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引物合成常見(jiàn)問(wèn)題
點(diǎn)擊次數:2674 更新時(shí)間:2022-12-26

Q1.引物是如何合成的?

目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。DNA合成儀有很多種,無(wú)論采用什么機器合成,合成的原理都相同,主要差別在于合成產(chǎn)率的高低,試劑消耗量的不同和單個(gè)循環(huán)用時(shí)的多少。

(1)    去保護:加入Deblocking脫去堿基上5'- OH的保護基團DMT,獲得游離的5'- OH;

(2)    耦合:同時(shí)加入活化劑和新的堿基,新的堿基5'-OH仍然被DMT保護,3'端被活化與溶液中游離的5'-OH發(fā)生耦合反應;

(3)    封閉:耦合反應中極少數5'- OH沒(méi)有參加反應,用封閉試劑終止其后繼續發(fā)生反應;

(4)    氧化:加入氧化劑使其由核苷亞磷酸酯形成更穩定的核苷磷酸酯。

Q2.引物合成如何處理?

切割與脫保護基:將合成好的寡核苷酸鏈從支持物上化學(xué)切割下來(lái)。常用新鮮的濃氨水來(lái)裂解CPG與初始核苷之間的酯鍵。斷裂下來(lái)的寡核苷酸帶有自由的3’羥基。

純化:根據所合成寡核苷酸的組成和應用來(lái)選定純化的方法。常用的純化方法有:C18、OPC、PAGE和HPLC。

定量:根據寡核苷酸在260nm處的紫外吸收來(lái)定量。

儲存:分裝抽干。

Q3.合成的引物5’端是否有磷酸化?

合成的引物5’為羥基,沒(méi)有磷酸基團。如果需要您可以用多核苷酸激酶進(jìn)行5’端磷酸化,或者要求我們合成時(shí)直接在5’或3’端進(jìn)行磷酸化,需要另外收費。

Q4.需要什么級別的引物?

根據實(shí)驗需要,確定訂購引物的純度級別。

應用

引物長(cháng)度要求

純度級別要求

一般PCR擴增

< 60base

HEPD

>60 base

PAGE

診斷PCR擴增

< 40base

HEPD, PAGE

DNA測序

20base左右

HEPD

亞克隆,點(diǎn)突變等

根據實(shí)驗要求定

HEPD, PAGE,HPLC

基因構建(全基因合成)

根據實(shí)驗要求定

HEPDPAGE

反義核酸

根據實(shí)驗要求定

HEPDPAGE

修飾引物

根據實(shí)驗要求定

PAGE, HPLC

Q5.需要合成多少OD數?

根據實(shí)驗目的確定。一般PCR擴增,2 OD引物,可以做500-1000次50ul標準PCR反應。如果是做基因拼接或退火后做連接,1 OD就足夠了。

Q6.如何計算引物的濃度?

引物保存在高濃度的狀況下比較穩定。一般情況下,我們建議將引物的濃度配制成100pmol/ul,稱(chēng)為保存濃度,而引物的工作濃度一般配制成10-50pmol/ul。加水的體積(微升)可直接參照合成報告單上推薦的體積,也可按下列方式計算:

V (微升)= OD數x 33 x 10000 /引物的分子量

引物的分子量可以從合成報告單上獲得。注意:1 OD260= 33 ug/ml。

溶解前您需要核對合成報告單和引物標簽上的引物OD數是否一致。如果不一致,請和我們。我們可以根據生產(chǎn)記錄查到實(shí)際產(chǎn)量是多少。

Q7.如何計算引物的Tm值?

引物設計軟件都可以給出Tm,與引物長(cháng)度、堿基組成及所使用緩沖夜的離子強度有關(guān)。

長(cháng)度為25base以下的引物,Tm計算公式為:Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)

對于更長(cháng)的寡聚核苷酸,Tm計算公式為:

Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (GC%) – 600/size

公式中,Size =引物長(cháng)度。

Q8.引物(含修飾)的分子量是如何確定的?

非修飾的引物的分子量(MW)在隨引物提供的報告單上可以找到。如果需要估計一個(gè)引物的分子量按每個(gè)堿基的平均分子量為324.5,引物的分子量=堿基數 x堿基的平均分子量,或按下列公式計算MW= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod)+(Nx * )+( NI* WI) +16* Ns–62.

NA, NG, NC, NT, NI分別為引物中堿基A或G或C或T或I的數量,WA, WG ,WC, WT, WI分別為引物中堿基A或G或C或T或I的分子量,Nmod,Wmod分別為修飾基團的數目和分子量。對于混合堿基的分子量為混合堿基的分子量總合除以混合數,例如G+A混合的分子量為(313.21+329.21)/2 = 321.21。Ns為硫代數目,硫代每個(gè)位置增加分子量16。

常規堿基分子量

Base

Molecular Weight

A

313.21

C

289.18

G

329.21

T

304.19

I

314.2

U

290.17

常規修飾基團分子量

5’-Biotin

405.45

3’-TAMARA

623.60

5’-(6 FAM)

537.46

3’-Dabsyl

498.49

5’-HEX

744.13

3’-(6 FAM)

569.46

5’-TET

675.24

3’-Amino Modifier C3

153.07

5’-Cy5

533.63

3’-Amino Modifier C7

209.18

5’-Cy3

507.59

3’-Thiol Modifier C3

154.12

Q9.如何溶解引物?

干燥后的引物質(zhì)地非常疏松,開(kāi)蓋前瞬時(shí)離心一下,或管垂直向上在桌面上敲敲,將引物粉末收集到管底。根據計算出的體積加入去離子無(wú)菌水或TE(pH8.0)緩沖液,室溫放置幾分鐘,振蕩助溶,離心將溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸餾水,因為有些蒸餾水的pH值比較低(pH4-5),引物在這種條件下不穩定。

Q10.如何保存引物?

引物合成后,經(jīng)過(guò)一系列處理和純化步驟,旋轉干燥而成無(wú)色或白色絮狀干粉。

干 粉:運輸時(shí)常溫運輸,-20℃可以保存一年。

儲存液:配好后分裝成幾管,避免反復凍融,-20℃可以保存半年。

工作液:常規使用,4℃保存,也可-20℃保存,但應避免反復凍融。

修飾熒光引物:需要避光保存,盡快使用為宜。

Q11.引物定量不準是怎么回事兒?

我們偶爾收到用戶(hù)投訴定量不準的報告,出現這種情況的可能性有:

(1)定量錯誤、分裝錯誤、引物抽干或收樣過(guò)程中意外丟失。這種可能性有,但是很少,因為作為專(zhuān)業(yè)的引物合成公司,我們的生產(chǎn)人員都是經(jīng)過(guò)嚴格的專(zhuān)業(yè)培訓,這種錯誤是要求謹慎避免甚至杜絕的。一般情況下,引物都有留樣備份,接到用戶(hù)投訴后,我們都會(huì )找出留樣重新定量,一般都沒(méi)有問(wèn)題,如確實(shí)存在問(wèn)題,則可安排重新準備一份。

(2)系統誤差,我們認為10%左右為允許誤差。使用過(guò)程中,引物工作濃度范圍很寬,定量上的少許偏差不影響實(shí)驗。

(3)用戶(hù)收到引物干粉時(shí),打開(kāi)引物管蓋前沒(méi)有離心或其他誤操作導致引物干粉部分丟失。

(4)用戶(hù)沒(méi)有能夠正確理解引物OD數的含義,沒(méi)有能夠正確使用分光光度計,特別是使用微量測定;用戶(hù)沒(méi)有將OD讀數,正確地轉換成母液中OD數。這種情況比較常見(jiàn)。

  例如,驗證標2OD引物量是否準確,簡(jiǎn)單的做法是:加入1ml水,*溶解混勻后,取100ul,加入900ul水,用光徑為1cm的石英比色杯,波長(cháng)260nm,此時(shí)光吸收的讀數為0.2。

Q12.zui長(cháng)可以合成多長(cháng)的引物?

我們合成過(guò)100base的引物,但是產(chǎn)率很低。除非需要,建議合成片段長(cháng)度不要超過(guò)80base。引物越長(cháng),出現問(wèn)題的概率就越大,按照目前的引物合成效率,大于80base的粗產(chǎn)品,全長(cháng)引物的百分比不高,后續處理還有丟失很多,zui后的產(chǎn)量很低。

Q13.為什么修飾引物的產(chǎn)量要比一般引物低,價(jià)格要高?

主要因為是修飾單體穩定性較差,偶連時(shí)間長(cháng),效率低,zui后得到的產(chǎn)量自然低于一般的引物。修飾引物通常需要PAGE或HPLC純化,純化過(guò)程損失大。修飾引物使用的原料是一般引物原料的幾百倍,所以產(chǎn)品的價(jià)格也高。

Q14.引物片段退火后不能連接到載體上是什么問(wèn)題?

連接反應需要引物的5’磷酸基團。如果需要將合成的引物退火直接連接相應的載體上,引物需要磷酸化。磷酸化的產(chǎn)物如果還不能連接載體上,需要檢查載體的酶切效果,需要改善引物退火的條件。SiRNA分子具有特殊的對稱(chēng)結構,退火的難度較大,退火時(shí)需要提高退火溫度。

Q15.如果測序發(fā)現引物突變,是否有補償?該如何處理?

如果出現測序發(fā)現引物位置堿基錯誤的情況,我們可以免費重合一次,沒(méi)有其他任何補償或賠償,不承擔其他連帶責任,這是行規。原因我們在前面已提到,化學(xué)合成效率不可能達到100%。

如果遇到這種情況,首先和我們,我們會(huì )檢查合成序列是否和原始訂單一致,如果確認引物合成序列沒(méi)有輸錯,我們建議重新挑取克隆測序,您可能會(huì )找到正確克隆的。根據我們經(jīng)驗,40個(gè)堿基以下的引物,測1-2個(gè)克隆就可以了;40個(gè)以上的特別是用于全片段拼接合成的,就需要多測一些了。一般情況下,每個(gè)克隆突變的位點(diǎn)都不一樣,正確的總是有的,就是如何找到它。您也可以要求我們將引物免費重合一次,不過(guò)重合的引物和*次的引物一樣,都可能含突變,不會(huì )因為重合的引物就減少您的遇到問(wèn)題的幾率?;蚱唇舆^(guò)程中,如果發(fā)現一段區域突變點(diǎn)不多,就多測幾個(gè),否則就重合一下引物。

根據全基因合成的數據,我們的引物能做到2000個(gè)堿基的片段,取三個(gè)克隆,其中至少有一個(gè)是正確的。

Q17.為什么引物的OD260/OD280小于1.5?

需要指出的是OD260/OD280的比值不能用來(lái)衡量引物的純度。OD260/OD280的比值過(guò)低一般是由于引物中C/T的含量比較高所致。下表是一個(gè)20base同聚體引物的OD260/OD280的比值,清楚表明OD260/OD280的比值與引物的堿基組成密切相關(guān)。

A260/280 ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base Compositions

Base Composition

A260/280

5-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3

2.50

5-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3

1.85

5-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3

1.15

5-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3

1.14

5-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-3

1.66

Q18.同樣的OD用PAGE檢測,EB染色為什么深淺不一?

通??梢杂肊B染色的方法來(lái)判斷雙鏈DNA的量(如質(zhì)粒DNA),因為EB可以嵌合到雙鏈DNA中。而合成的單鏈DNA,由于堿基組成不同,形成二級結構的可能性不同,EB的染色程度也會(huì )有差異,比如Oligo(dT)等不形成二級結構,EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的方法來(lái)定量,而用紫外分光光度計檢測。

Q19.如何檢測引物的純度?

實(shí)驗室方便的做法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。取0.2-0.5OD的引物,用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和,上樣前加熱變性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是變性,二是增加樣品比重,容易加樣。600V電壓進(jìn)行電泳,一定時(shí)間后(約2-3小時(shí)),剝膠,用熒光TLC板在紫外燈下檢測帶型,在主帶之下沒(méi)有雜帶,說(shuō)明純度是好的。如果條件許可,也可以用銀染方式染色。

Q20.已經(jīng)溶解的引物,為什么原先使用正常,而過(guò)一段時(shí)間再使用就不好了?

如果您溶解引物的水pH過(guò)低或污染了菌或核酸酶,會(huì )使引物降解。使用時(shí)沒(méi)有充分解凍混合,液體不均勻也可能會(huì )造成引物加入量不準確。建議分裝引物,避免反復凍溶。建議使用10mM Tris pH7.5緩沖液溶解引物,因為有些蒸餾水的pH值比較低(pH4-5),引物在這種條件下不穩定。還有一種可能性是引物沒(méi)有問(wèn)題,而是PCR使用材料特別是模板的質(zhì)量與先前使用的不*一致。

Q21.引物是我們設計的,現在您擴不出來(lái),我們要負責嗎?

不承擔相關(guān)責任。我們?yōu)橐恍?shí)驗經(jīng)驗不足的客戶(hù),免費設計引物,提供一定的便利。我們遵循一般的引物設計原則設計好引物之后都會(huì )發(fā)給您確認,而后再安排合成并保證引物質(zhì)量。但是設計的引物是否能夠滿(mǎn)足您的實(shí)驗要求,一定擴增出您需要的基因片段,誰(shuí)也不能100%保證。

Q22.PCR擴增無(wú)目的片段是引物質(zhì)量有問(wèn)題嗎?

PCR擴增無(wú)目的條帶或者非特異性擴增,影響因素是多方面的,需要耐心地分析,如模板結構與質(zhì)量、反應條件、引物設計等等。當今發(fā)展出各色各樣的PCR擴增技術(shù),各色各樣的高溫聚合酶,就是來(lái)解決PCR擴增中遇到的擴不出,擴增效率低的問(wèn)題。如巢式PCR就是擴增拷貝數很低的基因片段。通過(guò)提高模板質(zhì)量、優(yōu)化反應條件等方面找到對策,或者有必要時(shí)重新設計引物,在實(shí)驗時(shí)設置對照來(lái)判定原因。如果您懷疑引物的問(wèn)題,請您首先測定您溶解的引物的OD值,看實(shí)驗時(shí)加入的引物量是否正確。如果量是正常的,請您告訴我司您的引物編號,我們會(huì )復查留存樣品。如不明原因,我們免費為您重新合成一次。如果仍然不能擴增,請您查找其它原因。多數情況下我們復檢引物質(zhì)量都沒(méi)有問(wèn)題,因為我們在引物出售前已經(jīng)嚴格把好質(zhì)量關(guān)。

Q23.常用熒光染料參數

染料

Excitation
(激發(fā)波長(cháng), nm)

Emission

(發(fā)射波長(cháng), nm)

顏色

6-FAM

494

518

Yellow-green

Fluorescein

495

520

TET

521

536

JOE

520

548

Yellow

HEX

533

559

CY3

550

570

Yellow-orange

TAMRA

544

576

ROX

576

601

Orange

Cy5

650

670

Red

Q24.引物的質(zhì)量是不是跟序列有關(guān)?

四種堿基的性質(zhì)和各自保護基的性質(zhì)都有差別。所以合成難度是不一樣的。難度zui大的當屬GC重復多的和序列中還有多個(gè)連續的G的引物。尤其對于后者,國內公司一般都做不了20個(gè)G以上的引物。實(shí)驗證明,如果引物中有超過(guò)三個(gè)連續G的結構,傳統方法得到的產(chǎn)物質(zhì)量就會(huì )開(kāi)始下降。而且目前通用的脫鹽、OPC和PAGE方法都無(wú)效。

我們擁有的HEPD技術(shù)能夠克服高GC或者高G含量引物的合成和純化障礙,對普通引物、高GC引物和無(wú)論長(cháng)短的oligo d(G)都能得到同樣的非常好的結果